1.实验前准备

小鼠、病毒储存液(冰浴融化)、Hamilton微量注射器(50μL)配30G微针、超净工作台/生物安全柜、动物麻醉系统（异氟烷蒸发器与麻醉箱/鼻罩或小动物腹腔注射麻醉药物）、手术台、无菌眼膏、丁丙诺啡(术后镇痛）、镊子(直尖和弯尖)、微型蚊式止血钳、手术剪、持针器、加热垫或恒温水循环毯(维持动物体温)、手术照明系统(可调节冷光源)、无菌PBS(用于病毒稀释)、碘伏、70%乙醇(消毒用)、无菌手套、口罩、手术帽、手术衣、微量离心管(用于AAV稀释)、一次性无菌棉签和纱布

a.注射套装与病毒载体的准备

手术当天，从 −80 °C 冰箱取出病毒溶液，置于冰上解冻。

佩戴口罩、无菌手套及无菌手术衣。

准备一支 50 µL 的 Hamilton 微量注射器，该注射器已于前一日完成灭菌。

注意：按厂家说明对 Hamilton 注射器及针头进行灭菌处理。

病毒溶液完全融化后，用 70% 乙醇喷洒病毒管外壁，随后将病毒管移入超净工作台。在超净台内，用无菌PBS将病毒原液稀释至所需的滴度，再用无针头的 Hamilton 注射器吸取 50 µL 病毒工作液，装上 30 G 针头。将注射器垂直向上，轻推活塞，使病毒溶液充满针头（针头尖端出现第一滴溶液即可）。

注意：预先排尽气泡并确认针尖有液滴出现；实际死腔体积应根据所用针头和连接件型号预先测定。

b.麻醉及术前准备

向异氟烷蒸发器中加入 20 mL 异氟烷，并将蒸发器与氧气瓶连接。打开阀门，让氧气流入蒸发器，通过蒸发器上的流量计将氧气流量维持于 2 L/min。将小鼠放入与蒸发器相连的塑料麻醉盒中，以 4% 异氟烷 + 100% 氧气（2 L/min）诱导麻醉 2 min。取出已麻醉的小鼠，将其俯卧位固定于超净台内的塑料手术板上，继续通过鼻罩以 2% 异氟烷 + 100% 氧气（2 L/min）维持麻醉。

以“捏趾无回缩”确认麻醉深度足够。

双眼涂抹无菌眼膏，防止角膜干燥。

剃除胸部及上腹部被毛，涂脱毛膏 1 min，用湿纱布擦除脱毛膏及残留毛发。

用碘伏和70%乙醇交替对手术区域（左下胸部）进行三遍消毒，覆盖无菌洞巾。

2.病毒注射

a.更换新的无菌手套。镊子、微型蚊式止血钳、手术剪、持针器已于前一日完成高温高压灭菌。

b.沿剑突与腋窝连线做约 0.5 cm 皮肤切口，用镊子和微型蚊式止血钳钝性分离胸大肌与胸小肌。

牵开肌肉，显露肋间隙；用微型蚊式止血钳穿通并打开第 4 肋间隙（或目测最宽肋间隙）。

用非惯用手食指从右侧胸壁轻轻按压，将心脏推向切口，使心脏部分外置。再用非惯用手食指与拇指轻柔固定外置心脏。

c.用已装载病毒的 Hamilton 注射器，在惯用手操作下，将总计 30 µL 病毒溶液分三点（左心室腹壁、背壁及侧壁）注入心肌。

d.注射完毕后立即将心脏归位至胸腔。轻压胸壁向切口方向排气。

注意：若胸大肌、胸小肌出现扑动，提示胸腔空气已成功排出。

e.用 5-0 丝线水平褥式缝合皮肤。注意：胸大肌与胸小肌无需缝合，因手术全程仅行钝性分离，解剖结构保持完整。

f.术后管理

术后立即皮下注射丁丙诺啡（0.1 mg/kg），每日两次，连续 48 小时，以减轻术后疼痛。手术结束后，立即将小鼠置于 37 °C 保温垫上，直至其完全苏醒。待小鼠完全恢复后，再放回笼中。

密切监测小鼠的呼吸、活动水平、进食和饮水情况。一周内每日检查手术伤口是否有感染迹象，并记录体重变化。

使用过的 Hamilton 注射器及 30 G 针头需再次放入高温高压灭菌器灭菌。灭菌后的 30 G 针头收集于利器盒中。

图片来源：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC5933510/

3.常见问题和解决方案