AAV（腺相关病毒，Adeno-Associated Virus）病毒包装后的纯化是决定滴度、纯度和体内安全性的关键步骤。下面从主流方法、原理、优缺点及适用场景系统总结 AAV 病毒包装纯化方法

一、AAV 常用纯化方法总览

二、主流纯化方法详解

1️⃣ 碘克沙醇（Iodixanol）密度梯度离心 ⭐⭐⭐⭐⭐

原理：利用 AAV 完整颗粒与空壳在密度上的差异，在 15%–25%–40%–60% 梯度中分离。

流程简述

• 裂解细胞（反复冻融 / Benzonase 消化）

• 上样至碘克沙醇梯度

• 超速离心（≈ 350,000 g，2–3 h）

• 回收 40% 层病毒

• 超滤去除碘克沙醇并换缓冲

优点
✔ 可有效区分完整病毒与空壳
✔ 成本低、方法成熟
✔ 适合实验室规模

缺点
✖ 操作依赖经验
✖ 难以规模化
✖ 蛋白/宿主 DNA 去除有限

适用：科研实验、小规模体内外实验

2️⃣ 氯化铯（CsCl）密度梯度离心 ⭐⭐

特点

• 分辨率高，可严格区分 full / empty capsid

• 操作时间长（24–48 h）

• CsCl 对病毒有一定毒性

现状：已逐步被淘汰，仅用于早期或特殊机制研究

3️⃣ 柱层析法（Chromatography）⭐⭐⭐⭐

常见类型

• AVB Sepharose（亲和层析）

• 离子交换层析（IEX）

• 凝胶过滤（SEC，抛光步骤）

流程示例：裂解 → 过滤 → 亲和柱捕获 → 洗脱 → IEX 抛光 → 超滤换液

优点
✔ 高纯度、批间一致性好
✔ 可规模化、符合 GMP
✔ 宿主蛋白/DNA 去除能力强

缺点
✖ 成本高
✖ 不同血清型结合效率差异大（如 AAV5）

适用：临床前研究、IND、GMP 生产

4️⃣ PEG 沉淀 + 柱纯化 ⭐⭐⭐

原理：利用 PEG 将 AAV 从大体积上清中富集，再结合柱层析进一步纯化。

优点
✔ 适合大体积
✔ 回收率高
✔ 成本可控

缺点
✖ 纯度依赖后续步骤
✖ PEG 残留需严格控制

5️⃣ 超滤（TFF / Amicon）— 辅助步骤

用途

• 浓缩病毒

• 去盐、换缓冲（PBS、DPBS、Pluronic F68）

⚠️ 通常不作为单独纯化手段

三、不同应用场景的推荐方案

四、纯化后必做质量检测（QC）

• 病毒滴度（qPCR / ddPCR）

• 空壳比例（AUC / TEM / ELISA）

• 宿主 DNA 残留

• 宿主蛋白残留

• 内毒素（LAL）

• 无菌 / 支原体

五、常见问题提示

⚠️ 纯化后滴度低
→ 回收层不准 / 过度超滤 / 空壳比例高

⚠️ 体内毒性或炎症反应
→ HCP / DNA / 内毒素未充分去除

⚠️ 不同血清型回收差异大
→ 需针对血清型优化纯化策略