是目前科研与产业中最常用、最成熟的 AAV 载体包装方式，广泛用于体外实验和动物体内研究。

一、三质粒系统的组成

1️⃣ 转基因质粒（Transfer Plasmid）

核心功能：携带并表达目的基因

主要结构包括：

• ITR（Inverted Terminal Repeat）×2
  AAV 复制与包装所必需

• 启动子（Promoter）
  如 CMV、CAG、EF1α、hSyn 等

• 目的基因（GOI）

• PolyA 信号

⚠️ 注意：ITR 之间的总长度通常 ≤4.7 kb（包括启动子和调控元件）

2️⃣ Rep/Cap 质粒（包装质粒）

核心功能：提供 AAV 复制与衣壳蛋白

• Rep 基因：
  负责病毒基因组复制

• Cap 基因：
  决定 AAV 血清型（如 AAV2 / AAV8 / AAV9 等），影响组织嗜性

👉 更换 Cap 即可改变血清型

3️⃣ Helper 质粒（辅助质粒）

核心功能：提供腺病毒辅助因子

通常包含：

• E2A

• E4

• VA RNA

这些基因在 AAV 生命周期中是必需的，但不会被包装进 AAV 病毒颗粒，安全性高。

二、三质粒共转染的基本流程

1. HEK293 / HEK293T 细胞铺板

2. 按比例混合三种质粒

3. 使用 PEI / 商用转染试剂进行共转染

4. 转染后 48–72 h 收集细胞（主要病毒在细胞内）

5. 裂解细胞 → 病毒释放

6. 纯化（碘克沙醇梯度 / 柱纯化）

7. 滴度检测（qPCR / ddPCR）

三、三质粒系统的优势

✅ 不需要腺病毒感染，操作安全
✅ 血清型灵活可选
✅ 重复性好，适合规模化
✅ 与 GMP 工艺兼容性强

四、常见问题与注意事项

🔹 病毒滴度低

• 转染效率低

• Rep/Cap 质粒质量差

• ITR 结构受损

• 质粒比例不合适

🔹 感染效率低

• 血清型选择不合适

• 启动子与靶组织不匹配

• 给药方式不合理

🔹 无表达或表达弱

• ITR 突变
• 目的基因超出包装容量
• 细胞/动物模型不匹配